Mobile Phase & HPLC

เครื่อง High Performance Liquid Chromatography หรือที่เราเรียกกันย่อๆ ว่า HPLC เป็นเครื่องมือวิเคราะห์ที่มีการใช้การอย่างแพร่หลายในปัจจุบัน เพราะมีข้อได้เปรียบการหลายๆ อย่างเมื่อเทียบกับการวิเคราะห์ด้วยวิธีอื่นๆ ถ้าไม่คำนึงถึงประสิทธิภาพของเครื่อง ปัจจัยหลักที่มีผลต่อการวิเคราะห์คือ Chemical factors ตัวอย่างเช่น Absorption และ Stability ของสารที่มีอยู่ในตัวอย่างรวมไปถึงการเตรียม Mobile phase และอื่นๆ ล้วนแต่มีผลต่อ Sensitivity และ Repeatability ในการวิเคราะห์

สำหรับ Mobile phase เพื่อให้การวิเคราะห์ประสบความสำเร็จ และยืดอายุการทำงานขององค์ประกอบต่างๆ ของ HPLC ต้องพิจารณาถึงสิ่งต่างๆ ดังนี้

1. Solvent grade
2. Buffer solution
3. How to change mobile phase
4. Degassing

Solvent grade

ควรเลือกใช้ solvent ที่เป็น HPLC grade เนื่องจากมี cut off point ที่ wavelength ต่ำกว่า Analytical grade ทั่วไปและควรเลือกใช้ solvent ที่มี cut off point ต่ำกว่า wavelength ที่จะทำการวิเคราะห์ เพราะว่าถ้า Solvent มี background absorption จะทำให้ Noise มีค่าสูง, Baseline stability จะไม่ดี และ Linear range จะแคบลง

นอกจากนี้ Solvent บางตัวก็มีข้อจำกัดอื่นๆ เพิ่มเติมด้วย ตัวอย่างเช่น Tetrahydrofuran (THF) ใน analytical grade จะมีการเติม Butylated hydroxytolune (BHT) สำหรับทำหน้าที่เป็น oxidation inhibitor ซึ่งสารเคมีตัวนี้จะมี absorption ที่สูงมากในช่วง UV ทำให้ไม่สามารถใช้กับ UV-detector ได้แต่จะไม่มีการเติมสารนี้ใน HPLC grade ดังนั้นในการใช้ THF ที่เป็น HPLC grade จะต้องทำการเก็บ THF ไว้ในที่มืดและเย็นหลังจากการเปิดเพื่อป้องกันการระเบิด เช่นเดียวกันกับ Chloroform ถ้าเป็น analytical grade จะมีการเติม 3% ethanol เพื่อป้องกันการ generation ของ phosgene ซึ่งเป็น Toxic gas แต่การมี ethanol ใน chloroform นี้จะมีผลต่อการแยกของสารใน Normal phase mode แต่ใน HPLC grade จะไม่มีการเติม ethanol ดังนั้นเมื่อทำการเปิดขวดก็ควรจะเก็บในที่มืดและเย็นเพื่อป้องกันการเกิด generation

การเลือกใช้ Solvent grade รวมไปถึงการเลือกใช้น้ำให้เหมาะสมด้วย น้ำที่ใช้ในห้องปฏิบัติการมีให้เลือกด้วยกัน 3 grade คือ Pure water, Distilled water และ Deionized water ได้มีการทำการวัด absorption ของ deionized water เทียบกับ pure water จากกราฟจะเห็นว่า deionized water จะให้ absorption ที่สูงกว่าและอาจเป็นสาเหตุของการเกิด ghost peak เมื่อทำการวิเคราะห์แบบ Gradient elution

Mobile Phase & HPLC

Mobile Phase & HPLC
Buffer solutions
Degassing