การวิเคราะห์ Amino acid ด้วยเครื่อง HPLC

Amino acid เป็นสารที่มีทั้ง carboxyl groups และ amino groups อาจจะมีคุณสมบัติเป็นกรด ด่าง หรือเป็นกลางขึ้นอยู่กับ function groups และตำแหน่ง/ คุณสมบัติของ R

การแยก Amino acid ด้วยเครื่อง HPLC มีให้เลือกด้วยกัน 2 modes คือ Cation exchange mode กับ Reversed phase elution mode

1. Cation exchange mode เป็นวิธีที่ได้รับความนิยมและมีให้เลือก 2 วิธีคือ

a. การใช้ Na type cation exchange resin เป็น column ซึ่งเหมาะสำหรับการวิเคราะห์ amino acid ที่ได้จากการย่อยโปรตีน
b. การใช้ Li type cation exchange resin เป็น column วิธีนี้เหมาะกับการวิเคราะห์ biological amino acids และสามารถใช้แยก glutamine และ glutamic acid

2. Reversed phase elution mode เป็นการแยกโดยใช้ Column ODS (C-18) ธรรมดา อย่างเช่น Shim-pack HRC-ODS CAPCELL PAK C18, Intertsil ODS-3

สำหรับการตรวจวัดเนื่องจาก Amino acid มี Carboxyl groups ซึ่งสามารถดูดกลืนแสงในช่วง 200~210 nm จึงสามารถใช้ UV-detector ในการตรวจวัดแต่ไม่เป็นที่นิยมเนื่องจากมี Sensitivity ค่อนข้างต่ำ จึงต้องมีการทำ Derivatization เพื่อเพิ่ม sensitivity ในการตรวจวัด โดยต้องเลือกให้เหมาะสมกับ mode ในการแยกด้วย การทำ derivatization สามารถเลือกทำได้ 2 วิธีคือ

1. Pre-column derivatization method : นำตัวอย่างที่ต้องการทำการวิเคราะห์มาทำ derivatization ก่อนนำมาทำการแยกด้วย Column

เป็นวิธีการตรวจวัดที่ใช้ร่วมกับการแยกด้วย Reversed phase elution mode ซึ่งมีวิธีการให้เลือกทำ derivatizationได้หลายวิธีได้แก่

• DNP method
• OPA (o-phthalaldehyde) method
• Dansaylchloride method
• Fluorescamine method
• PTC method
• PTH method แต่ละวิธีมีข้อดีและข้อเสียเรียงลำดับดังนี้

วิธีที่ได้รับความนิยมมากที่สุดในการทำ Pre-column คือ OPA method เพราะมีความคงตัวอยู่นานพอที่จะทำการแยกด้วย reversed phase elution mode แต่ใน reagent ต้องมีการใช้ ethanethiol ซึ่งเป็นสารที่มีกลิ่นแรงมากและ OPA method ยังเป็นวิธีที่ให้ sensitivity ต่ำมากกับ Proline

2. Post-column derivatization method : นำตัวอย่างที่ต้องการวิเคราะห์มาผ่าน Column เพื่อทำการแยกก่อนเข้าสู่ขบวนการทำ derivatization

สามารถเลือกทำได้ 2 แบบ

• Ninhydrin method เป็น derivatization ที่ทำการวัดด้วย UV-detector
• OPA (o-phthalaldehyde) method จะใช้ fluorophotometer เป็น detector ที่ทำการวัด

OPA method จะให้ sensitivity สูงกว่า ninhydrin method ประมาณ 10 เท่า และการใช้ OPA method ในระบบ Post-column derivatization method สามารถเปลี่ยนสารใน reagent จาก ethanethiol มาใช้ mercaptoethanol แทนได้แต่ OPA method แบบปกติทั่วไปก็ยังไม่สามารถตรวจวัด Proline และ secondary amino acid ตัวอื่นๆ

Shimadzu ได้พัฒนาระบบของ OPA method จนสามารถวัด proline ได้และเปลี่ยนมาใช้ N-acetylcystein ซึ่งเป็นสารที่มีลักษณะเป็นผลึก ไม่มีกลิ่นทำให้สะดวกในการเตรียมและเพิ่ม sensitivityกราฟด้านล่างจะเป็นการเปรียบเทียบระหว่าง OPA method ทั่วไปกับ OPA method ซึ่งทาง Shimadzu ได้พัฒนาขึ้น

กราฟแท่งสีดำ เป็นตัวแทนของ Method ที่ใช้ AcCys ในขณะที่ กราฟแท่งแรเงา เป็นตัวแทนของ OPA method ปกติและกราฟแท่งขาวได้มาจาก chromatogram ซึ่งได้จาก method ซึ่งมีการเพิ่ม sensitivity ให้สามารถวิเคราะห์ Proline ได้ด้วยการเพิ่มความเข้มข้นของ OPA แต่สำหรับ glycin, alanine, cystine และ lysine การใช้ OPA ที่มีความเข้มข้นปกติจะให้ sensitivity ที่ดีกว่า ส่วนพวก aspartic acid, methionine, leucine และ arginine วิธีของ OPA จะให้ sensitivity ที่ดีกว่า แต่เมื่อเปรียบเทียบแล้วสัดส่วนที่ลดลงจะน้อยมาก ดังนั้น method ที่ได้พัฒนาถือว่าเหมาะสมเพราะสามารถทำให้วิเคราะห์สารได้ทุกตัวใน sensitivity ที่เหมาะสม

สรุป
Shimadzu HPLC amino acid analysis system สามารถทำการวิเคราะห์ amino acid ได้ถึง 17 ชนิดด้วยวิธีอัตโนมัติและกินเวลาเพียง 45 นาที โดยแต่ละสารจะถูกแยกด้วย gradient elution บน column ของ cation exchange ส่วนการตรวจวัดเป็นแบบ post-column derivatization ด้วย Fluorescence detector โดยใช้ OPA method ซึ่งให้ Sensitivity สูงกว่า ninhydrin ถึง 10 เท่า